ALIBIRD-CM, “alimento”, “beneficio”, “y (i)” “riesgo”, “salud”, sugiere el espíritu del consorcio: ALI: por alimento; BIRD: por pájaro, en sentido figurado: avanzar rápido (volar), que se constituyó con ocasión de la primera convocatoria de Tecnologías (2005) de Programas de actividades de I+D entre grupos de investigación de la Comunidad de Madrid.
ALIBIRD-CM 2009 ha desempeñado un papel importante en la creación, desarrollo y puesta en funcionamiento al servicio de la comunidad científica y de las empresas de tres plataformas avanzadas que son piezas básicas del planteamiento de ALIBIRD-CM 2013: i) Plataforma de Genómica Nutricional y Alimentación (GENYAL),gestionada por IMDEA Alimentación para la realización de estudios de intervención en humanos, incluyendo nutrigenética (http://www.alimentacion.imdea.org/plataformagenyal); ii) Plataforma de Innovación en la Industria Alimentaria (NOVALINDUS) gestionada por el CIAL, planta piloto especializada en el desarrollo de procesos de obtención de productos alimentarios funcionales (http://www.uam.es/novalindus); Plataforma de Metabolómica del CIAL, para el estudio de la compilación de metabolitos endógenos y la obtención de nuevos conocimientos sobre los mecanismos celulares a nivel molecular (http://www.cial.uamcsic.es/metabolomics.html).
Las investigaciones a desarrollar por el Programa de Actividades ALIBIRD-CM 2013 se encuadran en el Área Agroalimentación y Biotecnología, Línea Científico/Tecnológica: tecnologías avanzadas para la producción y caracterización de alimentos funcionales, mejora de la calidad y seguridad alimentaria, del anexo II de la convocatoria. La adecuación de la propuesta a la mencionada línea científico-tecnológica radica en su orientación hacia la obtención y caracterización de alimentos funcionales aplicando para ello tecnologías avanzadas. Por tanto, el objetivo científico-tecnológico general de ALIBIRD-CM 2013 es la búsqueda de la eficacia y seguridad de nuevos alimentos funcionales y complementos nutricionales para la prevención y/o mejora significativa de la ECV, la obesidad y el cáncer considerando un abordaje claro con dos pilares básicos: la aplicación de tecnologías alimentarias avanzadas para el desarrollo de productos más activos y biodisponibles y la profundización en los mecanismos moleculares de acción de los nutrientes con especial énfasis en las interacciones genes/nutrientes/ambiente. La relevancia del proyecto reside en perseguir una alta efectividad en los alimentos funcionales, no alcanzada con suficiente extensión en la actualidad. Ello supondría alcanzar la necesaria revolución en el ámbito de la alimentación-salud para que los alimentos funcionales y complementos nutricionales sean las fuentes de generación de valor añadido y competitividad que tanto necesita en la actualidad el sector de la alimentación y la nutrición. Resulta relevante, asimismo, lo que supondría para el bienestar de la población aportar mejoras en la salud cardiovascular, la obesidad y el bienestar de los pacientes de cáncer.
Objetivos Científicos
OBJETIVO 1: El diseño, desarrollo tecnológico y formulación de ingredientes alimentarios bioactivos para alimentos funcionales y complementos nutricionales orientados a la prevención y mejora de la enfermedad cardiovascular, la obesidad y el cáncer, su caracterización química, toxicológica y funcional
La intención del consorcio no es estudiar ingredientes bioactivos de forma aislada sino combinaciones de productos que aporten funcionalidades diversas y complementarias. Ello se debe a la hipótesis de que para lograr la reducción o modulación eficaz de biomarcadores de las tres enfermedades objetivo del proyecto es preciso asociar varios efectos como por ejemplo antiinflamatorios, antioxidantes, antiproliferativos, reguladores de la presión arterial y de la función intestinal. Los grupos participantes son expertos en la obtención y caracterización de ingredientes para su utilización en esta línea, por ejemplo prebióticos obtenidos por reacción de Maillard y reacciones enzimáticas, probióticos aislados de diferentes fuentes, péptidos bioactivos de proteínas lácteas o de huevo obtenidos mediante hidrólisis enzimática.
La dieta mediterránea es un patrón dietético ideal para combatir las enfermedades complejas y multigénicas. Sin embargo, la tendencia actual en la población española es la reducción de su adherencia a la misma. Para los propósitos de la presente propuesta es interesante tomar la dieta mediterránea como patrón básico dietético para la enfermedad cardiovascular, la obesidad y el cáncer, pero reforzando, mediante alimentos funcionales y complementos nutricionales, ciertos aspectos para lograr efectividad en la prevención y mejora de estas enfermedades. Concretamente, se sabe que muchos metabolitos secundarios de plantas familiares en el ámbito alimentario (flavonoides, diterpenos fenólicos, ácidos fenólicos, triterpenoides, carotenoides, terpenos y sesquiterpenos, entre otros) tienen fuertes efectos antiinflamatorios y antiproliferativos [Weng CJ et Al., 2012. Chemopreventive effects of dietary phytochemicals against cancer invasion and metastasis: phenolic acids, monophenol, polyphenol, and their derivatives. Cancer Treat Rev. 38, 76-87]. Muy conocido pero de continua actualidad por sus importantes efectos es el romero, pero existen otras fuentes menos exploradas que poseen alto interés potencial y que interesa estudiar como por ejemplo la manzanilla, millefolia, caléndula y la corteza del árbol Boswellia serrata (Shen Y et Al., 2011. Extracts Induce DNA Methylation Changes in Colon Cancer Cells. Gastroenterology 140-148]. En la producción de los extractos de estas materias primas naturales es necesario aplicar tecnologías eficientes, seguras, medioambientalmente limpias y con capacidad de ser selectivas para la recuperación de los compuestos bioactivos, como son la extracción con fluidos supercríticos, la extracción con líquidos presurizados (PLE) y la extracción asistida con ultrasonidos (UAE) [Azmir J et Al., 2013. Techniques for extraction of bioactive compounds from plant materials: A review. Journal of Food Engineering 117, 426-436]. El desarrollo de los procesos de extracción requiere una continua monitorización de la composición de los productos. Ello se realizará mediante metodología cromatográfica acoplada a espectrometría de masas. Igualmente se requiere la evaluación de la actividad biológica potencial de los productos, por ejemplo, la medida de la capacidad de captación de especies reactivas de oxígeno, mediante ensayo DCF utilizando como modelo la línea celular Caco-2, procedente de adenocarcinoma de colon, o la determinación de la actividad antiiflamatoria utilizando macrófagos humanos y utilización de kits de ELISA para determinar el nivel de citoquinas pro-inflamatorias y anti-inflamatorias.
La eficacia de los extractos naturales bioactivos como ingredientes funcionales pasa por su biodisponibilidad. Es conocido que la utilización de sistemas de vehiculización en lípidos mejorara la biodisponibilidad oral de compuestos bioactivos. La capacidad de los lípidos como vehículos se debe a que en el tracto gastrointestinal a partir de los triacilgliceroles (TG) se liberan 2-monoacilgliceroles (2-MG) y ácidos grasos libres por acción de la enzima lipasa pancreática. Estos productos presentan un mayor balance hidrofílico/lipofílico, por lo que se van dispersando en el medio acuoso junto con sales biliares y fosfolípidos, formando micelas mixtas. Una alternativa a los monoacilgliceroles es utilizar su análogo éter, 1-gliceril alquil-éter o alquilglicerol. Esta ligera diferencia estructural afecta significativamente a su comportamiento en la fase acuosa porque forma una fase hexagonal inversa (en lugar de una fase cúbica) en exceso de agua [Engström S et al., 2012. Cubic, Sponge, and Lamellar Phases in the Glyceryl Monooleyl Ether−Propylene Glycol−Water System.2012. Langmuir 23, 10020-10025]. El interés como vehículos de los alquilgliceroles es especial ya que estos productos pueden aportar además una acción inmunoestimuladora [Vitorino C et al., 2010. Effect of chronic supplementation with shark liver oil on immune responses of exercise-trained rats. European Journal of Applied Physiology 108, 1225-1232].
Por otro lado, es esencial determinar la seguridad de los ingredientes simples o combinados antes de su uso en humanos; para ello, se llevarán a cabo estudios de toxicidad en líneas celulares HepG2, SH-SY5 y Raw264.7 y animales de experimentación para identificar el NOAEL o el límite inferior de la dosis de referencia (DMDL), necesarios para el establecimiento de valores guía basados en criterios de salud como es la ingesta diaria admisible (IDA), o para calcular el margen de seguridad teniendo en cuenta la ingesta estimada del posible ingrediente o alimento funcional a estudio y así cuantificar el riesgo [A. Anadón et al., 2013. The role of in vitro methods as alternatives to animals in toxicity testing. Expert Opinion on Metabolism and Toxicology 10, 1-13].
OBJETIVO 2: La identificación de los mecanismos celulares y moleculares nutricionalmente relevantes de la enfermedad cardiovascular, obesidad y cáncer con especial énfasis en la genómica nutricional.
Son varios aspectos los que se estudiarán preferentemente en relación con este objetivo. En primer lugar los grupos GENECO y ONCOGENOM abordarán la genómica nutricional de la enfermedad cardiovascular, la obesidad y el cáncer. Los miRNAs han emergido recientemente como importantes moduladores de vías moleculares con asociación directa a las enfermedades crónicas [Bartel DP. 2009. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell 136, 215-233], por tanto, es importante realizar estudios dirigidos a desentrañar el papel de los miRNAs en la modulación de estas vías. Se llevará a cabo el estudio del efecto de los ingredientes bioactivos sobre la expresión de miRNAs relevantes en el metabolismo energético con especial hincapié en aquéllos relacionados con la enfermedad cardiovascular, la obesidad y el cáncer en modelos in vitro, que permiten conocer mecanismos moleculares de acción, y en modelos animales, que permiten manipular vías moleculares para conocer su efecto a nivel del organismo completo.
En el caso del cáncer, se llevará a cabo el análisis de la modulación de la expresión génica y miRNAs de ingredientes alimentarios bioactivos en células tumorales de cáncer de colon y páncreas, metodología de la que ya hay antecedentes [Wen et al. 2009. Ellagitannin (BJA3121), an anti-proliferative natural polyphenol compound, can regulate the expression of miRNAs in HepG2 cancer cells. Phytother. Res. 23, 778]. Ensayos con células humanas derivadas de cáncer de colon y páncreas: considerando la línea primaria senescente CCD841CoN como referencia, serán tratadas con la formulación desarrollada, con objeto de comparar células tratadas con los ingredientes bioactivos y células que no han recibido dicho tratamiento. La purificación de RNAs se hará según sistemas estándar de RNAeasy y control de calidad Agilent 2100 Bioanalyzer. El análisis del perfil de expresión génica de los RNAs obtenidos se realizará utilizando la plataforma de Affymetrix, y el perfil de expresión de miRNAs se efectuará por QT-PCR mediante paneles prediseñados de 754 miRNAs.
La exposición celular a factores asociados a un determinado régimen nutricional pueden alterar la expresión y funcionalidad de moléculas reguladoras de vías de señalización implicadas en el control celular y supresión tumoral; por tanto, es interesante realizar estudios de rutas de señalización celular para determinar el principal mecanismo de acción de los ingredientes o alimentos funcionales alimentarios con actividad biológica. Receptores de membrana de la familia de GPCRs tales como GPR40, GPR41, GPR43, GPR84 y GPR120 están implicados en obesidad, diabetes o arteriosclerosis [Talukdar S et al., 2011. Targeting GPR120 and other fatty acid-sensing GPCRs ameliorates insulin resistance and inflammatory diseases”. Trends Pharmacol Sci, 32, 543-550]. En este sentido, el grupo RESECEL explorará el efecto de ingredientes bioactivos en los niveles/funcionalidad de GRKs y moléculas asociadas relacionadas con la homeostasis metabólica (ATM y HDAC6), en tipos celulares relevantes en la progresión tumoral y en el contexto cardiovascular. La expresión de GRK2 se estimula en presencia de insulina y de IGF-1, así como por mediadores pro-inflamatorios y glucosa (datos preliminares del grupo RESECEL) en ciertos tipos celulares, mientras que la expresión de ATM está condicionada por el estado energético celular, disminuyendo en situaciones de activación de mTOR. Se han identificado además miRNAs reguladores de la expresión de GRK2 (miR- -23a and miR-181c, datos preliminares del grupo RESECEL) y ATM (miR-18a, miR-421, miR-106a) [Shen C & Houghton PJ. 2013. The mTOR pathway negatively controls ATM by upregulating miRNAs. Proc. Natl. Acad, Sci. 110, 11869-74]. Los modelos celulares mencionados y disponibles en el grupo RESECEL se expondrán a los ingredientes bioactivos de interés en presencia o no de sobrecarga “calórica” y se analizarán los niveles de proteína y mRNA de HDAC6, GRK2 y ATM con anticuerpos específicos y q-PCR, así como patrones de expresión de miRNAs mediante micro-arrays. Se propone también determinar la interrelación entre la dieta y el “background” genético asociado a diferentes “inputs” del factor regulador GRK2 en modelos animales y sus efectos sistémicos en la función cardiovascular y la progresión tumoral. El grupo BICECA añadirá a este objetivo el análisis del efecto de los ingredientes alimentarios bioactivos en la migración, invasión y capacidad de metástasis de células tumorales a través de ensayos de invasión con matrices extracelulares. El análisis de la capacidad metástatica de células tratadas con ingrediantes alimentarios bioactivos se realizará en ratones inmunodeprimidos, tras su inyección en la vena caudal. Se efectuarán ensayos de biología celular y bioquímicos para el análisis de la expresión de moléculas que participan en vías de señalización involucradas en el control de migración e invasión.
El grupo NUTRINVEST ha descrito recientemente el papel clave de la SerpinA3 en procesos de hepatocarcinogenesis, inhibiendo la proliferación de la célula tumoral y promoviendo su diferenciación. En tejido obtenido de pacientes con hepatocarcinoma (HCC) su expresión está reprimida, y cuando la proteína se localiza en el núcleo, inhibe el crecimiento de células de HCC tanto en modelos in vitro como in vivo. En estos últimos la sobreexpresión de SerpinA3 en células de HCC impide el desarrollo del tumor. Por otra parte, el análisis de datos de expresión en hígado procedentes de estudios high-throughput correlaciona bajos niveles de SerpinA3 con progresión tumoral y reducida supervivencia, apuntando un posible valor diagnóstico de esta proteína, al menos en HCC. Así, se propone el análisis de la expresión de SerpinA3 en células cancerosas, como parte de los mecanismos moleculares relevantes en el proceso tumoral. Las variaciones de los niveles de SerpinA3 y su localización intracelular podrían aportar datos relevantes sobre los posibles beneficios de la utilización de los ingredientes bioactivos o alimentos funcionales, tanto en modelos in vivo como in vitro.
En relación con la ECV resulta relevante profundizar en las acciones y efectos de los ingredientes bioactivos de la dieta, en especial los polifenoles, en la homeostasis lipídica y excreción de lípidos en modelos de depósito intracelular de colesterol. El grupo CNO estudiará en condiciones in vitro los efectos sobre el tráfico intracelular de lípidos de xenobióticos (aminas anfipáticas) para establecer sus mecanismos e identificar un tratamiento que permita descongestionar las células del depósito de lípidos y restablecer la homeostasis intracelular. La obesidad tiene efectos sobre la exportación y el transporte reverso de colesterol así como su relación con el riesgo cardiometabólico. Al respecto se estudiará el transporte reverso de colesterol desde macrófagos y adipocitos en ratones. Los macrófagos peritoneales de ratón o adipocitos 3T3L1 se marcarán con [3H]colesterol, se inyectarán i.p. en ratones aceptores y se determinará la radiactividad en el plasma, hígado y heces a las 48 h. Se estudiará la expresión de miRNA en biopsias de tejido de pacientes sometidos a cirugía bariátrica y de controles normopeso, se realizará un análisis mediante el “Human Whole Genome miRNA Array” por qPCR. Los miRNAs de interés se analizarán en plasma mediante el sistema “miScript PCR System” utilizando el LightCycler 480 System.
OBJETIVO 3: La demostración de la eficacia en humanos de los alimentos funcionales y complementos nutricionales desarrollados y su aplicación a la nutrición personalizada para la prevención y mejora de la enfermedad cardiovascular, obesidad y cáncer
La obesidad tiene una clara relación con la enfermedad cardiovascular y aumenta de manera sustancial el riesgo de padecer ciertos tipos de cáncer como el de mama y colon. En estos casos, parece que la obesidad puede relacionarse con el origen de estos tumores [Bardou et al. 2013. Obesity and colorectal cancer. GUT 62, 933-947] así como con su pronóstico y evolución. Respecto a lo primero, cada vez hay más evidencias que sugieren que el metabolismo energético, y más concretamente el de los lípidos, desempeña un papel crucial en la tumorogénesis de numerosas neoplasias. Los cambios en el metabolismo lipídico pueden afectar a numerosos procesos celulares, incluyendo el crecimiento celular, la proliferación, diferenciación, etc. Respecto a lo segundo, se ha relacionado el sobrepeso con un mayor riesgo de recidiva. Así por ejemplo, se sabe que las mujeres con cáncer de mama y obesidad o aquellas que ganaban peso después del diagnóstico, tienen un riesgo aumentado de recidivas y mortalidad comparadas con aquellas que mantienen un peso normal. Con respecto al cáncer de colon, se ha observado que el aumento de peso se asociaba con un mayor riesgo de sufrirlo [Kitahara CM, 2013. Body fat distribution, weight change during adulthood, and thyroid cancer risk in the NIH-AARP Diet and Health Study. International Journal of Cancer 130, 1411-1419] y un mayor riesgo de recidiva tras la cirugía (Sinicrope FA. 2013. Body mass index at diagnosis and survival among colon cancer patients enrolled in clinical trials of adjuvant chemotherapy. Cancer 119, 1528-36]. Por tanto, en este proyecto se plantea, además, el desarrollo de un programa dirigido a la caracterización genética de los pacientes con cáncer de mama y colon, para identificar biomarcadores genéticos de la progresión de la enfermedad y de resistencia a los tratamientos. Se llevará a cabo la caracterización genética de los pacientes incluidos en el estudio, tanto en rutas metabólicas como hormonales clave en la progresión tumoral, valorando tanto la expresión génica como los cambios epigenéticos, miRNAs y polimorfismos asociados a esos genes, la identificación de biomarcadores genéticos asociados al desarrollo, evolución y/o respuesta al tratamiento de la enfermedad y se prestará una especial atención a la identificación de diferencias moleculares y asociadas a rutas metabólicas entre los tumores desarrollados en personas con sobrepeso y/o aumento del perímetro abdominal frente al resto.
A partir de los resultados de los estudios básicos-orientados sobre mecanismos moleculares se diseñarían dietas con la estructura básica de la dieta mediterránea específicamente reforzadas con los complementos nutricionales que ofrezcan mejores perspectivas de eficacia. Dichas dietas se ensayarían en diversos estudios clínicos siempre con enfoque nutrigenético. Concretamente se prevé llevar a cabo los siguientes: Un estudio de intervención nutrigenética con el Complemento Nutricional 1 en humanos con sobrepeso/obesidad; un estudio de intervención nutrigenética con el alimento cárnico funcional en humanos con sobrepeso/obesidad. En estos dos primeros estudios, se tratará de validar la efectividad de los alimentos de uso específico para la salud en el ámbito del sobrepeso/obesidad pero también de profundizar en el conocimiento de la modulación de la expresión génica y microRNAs de los productos y de las principales rutas moleculares de acción, identificando de posibles marcadores moleculares de respuesta al producto.
Las tareas del Objetivo 3 incluyen otros 4 estudios en humanos: Dos estudios clínicos en cohortes de pacientes oncológicos con dietas personalizadas incluyendo alguno de los complementos nutricionales desarrollados. Se trata de seleccionar y determinar la pauta de administración y efectividad de los productos desarrollados como complementos adyuvantes en la terapia antitumoral de pacientes con cáncer; dos estudios de intervención nutrigenética en el ámbito del riesgo cardiovascular/obesidad con dietas personalizadas incluyendo alguno de los complementos nutricionales desarrollados. Se pretende evaluar la eficacia en términos de mejoría metabólica, especialmente en el metabolismo del colesterol, en pacientes obesos. En la realización de estos estudios intervendrán los grupos GENECO y ONCOGENOM de IMDEA Alimentación con la Plataforma de Genómica Nutricional y Alimentación (GENYAL), así como los grupos de los hospitales que participan en el Programa: NUTRINVEST, ONCOLAB, POL y CNO, y el Laboratorio de Genómica del Parque Científico de Madrid. Todos los grupos participantes cuentan con experiencia y recursos humanos para la realización de ensayos clínico-nutrigenético prospectivos, paralelos/cruzados y aleatorizados. Para todos los ensayos previstos se llevará a cabo la preparación de documentación y presentación a aprobación por el Comité de Ética de la Investigación (CEI) correspondiente. Todos los hospitales, así como IMDEA Alimentación cuentan con CEI. El reclutamiento se realizará según el enfoque de cada estudio. Todos los voluntarios que cumplan los criterios de inclusión firmarán un consentimiento informado previamente valorado por el CEI. Se realizará una valoración antropométrica junto con una recogida de datos de hábitos dietéticos y de actividad física, historial médico, etc… El tratamiento de datos se realizará por medio de una Aplicación Web de Control de Proyectos propia, dinámica y funcional, diseñada mediante un sistema de disociación de datos y capacidad para anonimizar cumpliendo con la Ley Orgánica 15/1999 de Protección de Datos de Carácter Personal. En la fase de intervención los participantes serán aleatorizados en 2 grupos que recibirán de forma aleatoria dieta con complemento nutricional o alimento funcional, según el caso o dieta control durante el período determinado. En las visitas que se establezcan se recogerán datos antropométricos, encuestas nutricionales y de estilo de vida, y se realizarán charlas informativas sobre el ensayo y educación nutricional. Se obtendrán muestras de sangre y/u orina para realizar las caracterizaciones bioquímicas y obtener ADN y ARN para las determinaciones genéticas según lo establecido en el Real Decreto 1527/2010 de la Ley de Investigación Biomédica. Los análisis clínicos se llevarán a cabo en los laboratorios pertinentes de cada hospital y la determinación de variantes genéticas se realizará en IMDEA Alimentación. El análisis de datos combinará marcadores relacionados con la actividad del producto, parámetros antropométricos, perfil lipídico, marcadores de inflamación y oxidación, y presencia y modulación de microRNAs plasmáticos. Incluirá el estudio de asociación entre la presencia de las distintas variantes genéticas y la modulación de los marcadores mencionados. Este análisis se llevará a cabo en la Unidad de Bioestadística de la Plataforma GENYAL